一、介紹

小鼠精原細胞（GC-1 spg）為貼壁細胞，細胞形態呈上皮細胞樣。

二、主要耗材、儀器及試劑

15ml離心管、50ml離心管、凍存管、巴氏滴管、培養瓶、封口膜、CO2培養箱、離心機、顯微鏡、生物安全柜、DMEM、胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液、青-鏈霉素（雙抗）、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）等等。

三、培養流程

1. 細胞復蘇

1)擦拭生物安全柜臺面，準備好所需耗材，紫外30min，打開37℃恒溫水浴箱預熱所用試劑；

2)按照DMEM＋10% FBS＋1% P/S的比例配制血清培養基，吹打混勻后按10倍細胞的體積分裝至15ml離心管中；

3)從液氮中取出GC-1 spg細胞，在水浴箱中快速晃動使其融化；

4)將細胞懸液轉移至提前分裝有血清培養基的離心管中，吹打混勻；

5)1200rpm，離心3min；

6)棄去廢液，向離心管中重新加入新的培養基，重懸GC-1 spg細胞沉淀，并轉移至培養瓶中進行培養。

2. 細胞傳代

1)細胞密度超過80%即可進行傳代，拿出細胞，棄去舊培養液；

2)用PBS沖洗細胞2-3次（動作要輕柔，清洗時可搖晃培養瓶以保證清洗效果）；

3)棄去廢液，向培養瓶中加入事先預熱好的胰蛋白酶（用量要足以覆蓋細胞層），輕輕晃動培養瓶以利于消化；

4)1min左右后在顯微鏡下觀察細胞，當90%細胞被消化下來時，向培養瓶中加入2-3ml的血清培養基，終止消化；

5)收集細胞懸液至15ml離心管中，1200rpm，離心3min；

6)等待離心過程中，可提前在新的培養瓶中加好完培（如T25培養瓶可先加4ml完培）；

7)棄去廢液，用2ml的完培重懸細胞后分裝至新的培養瓶中；

8)蓋上培養瓶蓋子，以劃“十字"的方式晃動培養瓶，以使細胞分布均勻，置于37℃，5%-10%CO2培養箱中進行培養。

3. 細胞凍存

1)從培養箱中取出培養瓶，棄去舊的培養液，用PBS清洗2-3次；

2)加入預熱的胰蛋白酶消化細胞，鏡下觀察消化后加入2-3ml完培終止消化；

3)收集細胞懸液至15ml離心管中，1200rpm，離心3min；

4)等待離心過程中，按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制凍存液；

5)離心結束后，棄去上清，向離心管中加入凍存液，重懸細胞，分裝至凍存管中；

6)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"），置于-80℃冰箱中，第二天即可拿出細胞置于液氮罐中保存。

四、注意事項

1．培養細胞所用的培養基及血清等試劑最好沿用之前的，切忌頻繁更換；

2．棄去舊的培養液時最好不要直接倒掉，以免瓶口有殘留造成污染；

3．用胰酶消化細胞時，可輕輕晃動培養瓶，并在顯微鏡下觀察，細胞間隙變大，輕晃培養瓶細胞可自然流下時即可終止消化，切忌劇烈拍打培養瓶；

4．對于難消化的細胞可以分兩次進行消化，以防胰酶消化時間過長對細胞造成損傷；

5．一定要分清細胞培養瓶的正反面。

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